一、治疗方法

    （一） 病例选择
    常规应用肾上腺皮质激素和/或柳氮磺胺吡啶治疗1个月以上无效或恶化的溃疡性结肠炎患者18例, 男8例, 女10例, 平均年龄32.4岁, 均符合1993年太原全国慢性非感染性肠道疾病学术研讨会制定的溃疡性结肠炎诊断标准。 其中重度10例, 中度8例, 病程7个月至10年, 平均4.3年, 临床表现为便血、腹泻、黏液脓血便及腹痛症状。 3例患者伴有相关的血栓性疾病。 舌下含服抗栓灵含片(低分子肝素钠, 鲁卫药准字1996-072523) 2片(相当于低分子肝素钠2400U)，3次/日, 15d后改为1片/次, 继续同时维持柳氮磺胺吡啶现用量, 逐渐减少肾上腺皮质激素用量。 正常人对照组20例, 平均年龄30.6岁, 均为健康查体者。

    （二）观察指标
    1. 临床指数评价  分别在治疗前和治疗后对下列临床指数进行量化，以评价治疗效果：
（1） 大便次数（过去1周每日的大便次数）。
（2）  便血：0分：无；1分：偶尔有少许血便；2分：经常有明显的血便；3分：全部为血便。
（3） 肠镜下表现：根据改良的Baron评分标准分为：0分：正常黏膜图像；1分：轻度病变，即血管纹理模糊，黏膜充血但无出血; 2分：中度病变，黏膜呈颗粒样变化；3分：重度病变，黏膜溃疡并自发性出血。
（4）组织学分级：将溃疡性结肠炎的5项组织学特征（炎性细胞浸润、隐窝炎、隐窝脓肿形成、杯状细胞不成熟、黏膜上皮增生）每项分为4级（0分：无；1分：轻度；2分：中度；3分：重度），总分小于5分为轻度病变，5~10分为中度病变，10~15分为重度病变。
(5)全身健康： 0=很好，1=好，2=较差，3=差，4=很差，5=极差。
2. 血小板活化的检测  血小板活化的膜标志物可溶性黏附分子P-选择素(CD62p)及GP53(CD63)采用流式细胞仪(FACScan型, 美国Becton Dickinson公司产品)测定。 主要试剂:异硫氰酸荧光素(FITC), 标记的鼠抗人P-选择素(CD62p-FITC), 鼠抗人GP53(CD63-FITC), 同种荧光素标记的阴性对照羊抗鼠IgG1-FITC, 均为法国Immunoteche公司产品。 取静脉血2ml, 20g/L EDTA抗凝, 1 500 r/min离心5 min, 取上清液, 以80g/L多聚甲醛室温固定15 min, 用PBS漂洗3次, 2 000 r/min, 离心5 min, 调整血小板浓度为300×109/L, 将20μL CD62p-FITC、CD63-FITC及IgG1-FITC分别加入上述富含血小板血浆100μl 中, 混匀室温避光30 min, 用PBS洗一遍, 弃上清, 上机。 上机前先以标准微球调整仪器, 使变异系数在2%以内, 上机后收集20 000~50 000个细胞, 荧光强度以对数放大, 光散射数据存软盘, 结果采用Macintosh 650型计算机及Cell Quest Plot软件进行数据分析, 以阳性细胞百分数表示。 TXA2稳定的代谢产物TXB2(药盒由苏州医学院提供)采用放免法测定, 按操作说明进行。 血小板黏附率（PAR）采用XSNRII血栓形成、血小板黏附两用仪(无锡电子仪器二厂)测定。
3. 血液和组织中CD54、 Pgp-170 检测
(1) 试剂来源 异硫氰酸荧光素(FITC)标记的鼠抗CD54(CD54-FITC), Pgp-170 (Pgp-170-FITC), 同种荧光素标记的阴性对照羊抗鼠IgG1-FITC均由法国Immunotech公司生产; 淋巴细胞分离液由中国医学科学院血液研究所生产。
(2) 血液样本Pgp-170、CD54的制备  分别取肝素抗凝血2 ml, 重层于淋巴细胞分离液上, 1500 r/min, 离心15 min, 提取其中淋巴细胞层, 再以PBS 3 ml洗2次, 弃上清后用700ml/L乙醇固定, 4℃备用。将制备的细胞悬液分3管, 每管100μl, 一管加入20μl Pgp-170-FITC单抗溶液, 一管加入20μl CD54-FITC, 另一管为阴性对照, 加20μl羊抗鼠IgG1-FITC, 室温避光反应5 min, PBS洗1次, 弃上清液, 以除去未结合的抗荧光抗体。
(3) 组织样品处理 溃疡性结肠炎患者肠镜检查时用活检钳取结肠溃疡边缘新鲜组织约0.2g, 正常人在乙状结肠处取新鲜组织约0.2g, 置于重叠的100目铜网及260目尼龙网上, 用眼科剪剪成1mm×1mm×1mm 碎块, 然后用眼科剪轻搓, 边搓边用磷酸缓冲液(PBS)冲洗入小烧瓶中, 直至组织搓净。 1500 r/min离心5 min, 再用PBS洗2次, 1000 r/min, 离心2 min, 重层于淋巴细胞分离液上, 再以PBS 3ml洗2次, 弃上清后用700ml/L乙醇固定，4℃备用。
(4)免疫反应  反应前调整细胞数至1012/L, 分取100μl放入3支试管内，试管内分别加20μl  CD54-FITC、Pgp-170-FITC和 IgG1-FITC, 室温避光反应30 min, 上机。(5) 流式细胞仪检测 流式细胞仪为FACScan型, 美国Becton Dickinson公司生产。 上机前先以标准荧光微球调整仪器变异系数在2.0%以内, 上机后收集10000个细胞, 荧光强度以对数放大, 测定光散射数据, 结果采用Macintosh 650型计算机及Cell  Quest  Plot软件进行数据分析, 以阳性细胞百分数表示 。
二、疗效
(一) 临床疗效
16例患者在加用抗栓灵含片治疗后获得临床缓解，大便次数正常，2例患者仅表现为便血减少，症状显著改善的平均时间为3周(1~5周), 临床缓解的平均时间为6周(1~12周), 4例患者便血在1~2周停止，其余患者2 ~6周停止（表5-3-1）。

表5-3-1 抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎的临床疗效
组  别 大便次数 便血（分） 内镜下表现（分） 组织学（分） 全身症状（分）
治疗前 8.2 2.7 2.6 12.0 3.9
治疗后 1.6b 0.3b 1.1b 5.0b 0.7b
注： b. P<0.01, vs 治疗前。
(二) 抗栓灵含片对CD62P、CD63、TXA2 , PAR和体外血栓长度的影响 见表5-3-2。
表5-3-2抗栓灵含片对CD62P、CD63、 TXA2、 PAR和体外血栓长度 (TL) ( ±s)的影响
组别 CD62P(%) CD63(%) TXA2(ng/L) PAR(%) TL(cm)
溃疡性结肠炎患者 　 　 　 　 　
治疗前 8.0±3.1b 6.3±2.1b 548.2±84.9b 43.2±10.1b 2.3±0.6b
治疗后 4.1±1.8a,d 3.2±1.6a,d 390.1±67.0d 34.8±8.1d 1.8±0.3d
正常人 1.9±0.4 1.6±0.8 340.2±40.4 34.1±9.1 1.7±0.4　
注：a.P<0.05; b. P<0.01, vs正常人;  d. P<0.01, vs 治疗前。
表5-3-2可以看出，与正常人相比, 难治性溃疡性结肠炎患者血小板活化的膜标志物P选择素、GP53, 血小板活化的衍生物TXB2及血小板活化后聚集反应血小板黏附率均明显升高(P<0.01), 应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0.05), 但CD62p、CD63仍明显高于正常人(P<0.05)。
（三）抗栓灵含片对血液和组织中CD54的影响 见表5-3-3。
表5-3-3 抗栓灵含片对血液和组织中CD54( ±s，%)的影响 
组别 血液中CD54 组织中 CD54
溃疡性结肠炎患者 　 　
  治疗前 26.9±6.9b 51.1±6.2b
  治疗后 14.4±5.1a,d 23.1±4.1a,d
正常人 6.2±3.7 8.8±3.2
注：a.P<0.05; b. P<0.01, vs正常人;  d. P<0.01, vs 治疗前。
表5-3-3中可以看出，与正常人相比,难治性溃疡性结肠炎患者血液中CD54 明显升高，尤以组织中升高更为明显，应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0.05), 但仍明显高于正常人(P<0.05)。
(四) 抗栓灵含片对血液和组织中Pgp-170的影响 见表5-3-4。
表5-3-4抗栓灵含片对血液和组织中Pgp-170 ( ±s，%)的影响 
组别 血液中Pgp-170 组织中 Pgp-170
溃疡性结肠炎患者 　 　
  治疗前 18.9±3.9b 16.5.1±3.2b
  治疗后 10.4±2.7a,c 10.2±2.3a,c
正常人 6.2±2.2 6.8±3.1
注：a.P<0.05; b. P<0.01, vs正常人;  c. P<0.05 vs 治疗前。
表5-3-4中可以看出，与正常人相比,难治性溃疡性结肠炎患者血液中Pgp-170明显升高，血液和组织中无显著性差异，应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0.05), 但仍明显高于正常人(P<0.05)。
三、讨论
抗栓灵含片是以低分子量肝素类物质（Mr 5 000~15 000，峰值5 000~8 000）为主要成分的舌下含服制剂，为白色或类白色，每片相当于1200 IU的低分子肝素钠，所含肝素经特殊加工，Mr小, 舌下黏膜吸收，既避免了口服制剂的首过效应，生物利用度高，又避免了注射给药不便，出血等，不良反应少。肝素除具有抗凝、抗血栓、抗过敏、抗内毒素血症和免疫活性外，还有较强的抗炎作用，低分子肝素含有大量8~16单糖单位的糖链，具有抗血栓作用强、出血倾向小、安全性高、半衰期长和生物利用度高等优点。 肝素类药物治疗顽固性溃疡性结肠炎有肯定疗效的报道启发我们应用抗栓灵含片是否更为方便和有效。 结果显示，18例伴血小板活化的顽固性溃疡性结肠炎患者有16例获得临床缓解，症状消失。同传统的观点认为应用肝素类药物有可能加重出血倾向相反，应用抗栓灵含片治疗后，便血消失往往是治疗有效的最早反应，这同其他应用肝素类药物治疗的结果类似。
研究抗栓灵含片的作用机理可能对阐明溃疡性结肠炎的部分发病机制具有一定作用。 溃疡性结肠炎患者易合并血栓形成, 发生率可高达45.2%, 并认为这与溃疡性结肠炎患者伴发高凝状态有关。由于血小板不仅参与止血和血栓形成, 而且是一种炎症介质, 其在溃疡性结肠炎发病机制中的作用开始引起人们的重视。 P-选择素属黏附分子选择素家族的组分之一, 由活化血小板和内皮细胞分泌表达, 并可作为这些细胞活化的标志, 介导中性粒细胞和单核细胞对活化血小板和内皮细胞的黏附。 CD63抗原为53kD的溶酶体膜粘蛋白, 在血小板激活后跨位于浆膜, 主要见于单核细胞和巨噬细胞, 可用于活化血小板的检测。 我们发现, 难治性溃疡性结肠炎患者P-选择素及GP53较正常人明显升高, 表明血小板处于高活化状态, 其可能机制为: ①肠系膜血管系统内皮细胞损伤暴露于血小板极敏感的基底膜胶原, 并激发血小板活化。 炎症性肠病患者血清中vonWillebrand因子(内皮细胞损伤的一种标志)增多与这一可能性相符; ②内毒素和其他吸收的细菌产物激活的单核细胞和中性粒细胞也可激活血小板; ③血小板和活化的中性粒细胞在肠道病变部位将TXA2和PAF释放至肠系膜循环, 可加速和促进血小板活化, 本研究中TXA2明显升高与这一可能性相符。 血小板活化在溃疡性结肠炎发病机制中可能的作用: ①活化的血小板通过局部释放炎症介质、化学趋化物(如PF4、PAF)及激活其他炎症细胞参与和增强肠黏膜炎症过程。 P-选择素在中性粒细胞黏附分子中起关键作用, 血小板表达此种抗原使中性粒细胞更易在炎症部位聚集; ②血小板活化及其衍生的TXA2易使血小板聚集阻塞肠黏膜微循环, 加重肠黏膜缺氧和损伤, 本研究也证实血小板黏附率升高。另外, TXA2通过引发局部血管收缩可加重缺血; ③血小板衍生因子(成纤维细胞和单核细胞的化学诱导剂)从活化的血小板释放出来, 在组织损伤后的修复机制中起重要作用。我们还发现, 应用抗栓灵含片治疗后，难治性溃疡性结肠炎患者P-选择素、GP53、TXB2及血小板黏附率较活动期有所下降, 说明抗栓灵含片可抑制血小板活化，改善高凝状态，从而减轻临床症状，但P-选择素、GP53仍明显高于正常人, 提示部分难治性溃疡性结肠炎患者仍存在血小板激活状态, 是否对疾病复发或预后有预测意义尚待进一步探讨。
CD54抗原也称细胞间黏附分子-1(ICAM-1), 表达于内皮细胞、上皮细胞,、成纤维细胞、白细胞和多种类型的肿瘤细胞。 1991年Sethetal用免疫印迹方法首次证实人血清中存在可溶性CD54, 并具有以下特征: ①含有膜表面CD54分子的大部分细胞外功能区; ②具有与其配体淋巴细胞功能相关抗原(lymphocyte function-associated antigen-1, LFA-1)结合的能力; ③与白细胞表面的LFA-1配体结合能阻止白细胞与组织固有细胞之间的黏附。 我们采用流式细胞免疫学方法检测溃疡性结肠炎患者循环中可溶性CD54及组织中CD54, 较正常人明显升高, 尤以组织中升高更为明显, 由于CD54主要介导细胞与细胞间的黏附作用, 在组织炎症的产生过程中, 随着浸润的炎症细胞及组织固有细胞的活化, CD54的表达被上调, 高表达的CD54又可进一步促进炎症细胞的浸润, 引起并加重组织损伤，因此, CD54与溃疡性结肠炎活动和转归有一定关系。应用抗栓灵含片后，CD54显著下降, 表明难治性溃疡性结肠炎患者炎症反应明显减轻，由于这些患者均为长期（大于4周）应用肾上腺皮质激素和/或柳氮磺胺吡啶治疗无效，因此炎症减轻与加用抗栓灵含片有关，其他学者也报道肝素类药物可抑制溃疡性结肠炎患者C-反应蛋白、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)和L-选择素，确切机理还需进一步探讨。
P-糖蛋白是170kD的多药抗性基因(MDR)产物 (Pgp-170)，被看做具有广谱底物特异性的ATP-依赖性药物排出泵的作用。MDR在肠上皮细胞和淋巴细胞均有表达。 我们发现, 与正常人相比, 难治性溃疡性结肠炎患者血液中Pgp-170明显升高，由于肾上腺皮质激素是Pgp-170的底物，药物治疗无效的溃疡性结肠炎患者与MDR表达有关。 血液和组织中无显著性差异，提示外周血MDR表达稳定，不受疾病活动或肾上腺皮质激素治疗影响，且与结肠上皮细胞表达呈正相关。 应用抗栓灵含片治疗后较治疗前显著下降(P<0.05), 说明抗栓灵含片对多药抗性有一定的抑制作用，但Pgp-170仍明显高于正常人(P<0.05)。 因此MDR在溃疡性结肠炎患者对肾上腺皮质激素治疗的反应中可能起重要作用。
总之，抗栓灵含片治疗伴有血小板活化的难治性溃疡性结肠炎有肯定的疗效，其机理可能与部分抑制血小板活化和高凝状态、减轻炎症、抑制多药耐药基因表达有关。结合我国溃疡性结肠炎发病特点，探讨适合不同类型的溃疡性结肠炎治疗方法，仍是当前研究的重点和难点。
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